Globale Expressionsprofile Pneumokokken-infizierter Bronchialepithelzellen - Einfluss der miRNA-3135b und des Nicotinamidstoffwechselweges auf die bakterielle Replikation

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), auch als Pneumococcus bezeichnet, ist ein grampositives Bakterium, welches gewöhnlich als Kommensale asymptomatisch den humanen Nasopharynx besiedelt, jedoch auch schwere Erkrankungen bis hin zur Sepsis oder Meningitis auslösen kann. Pneumokokken sind Hauptverursacher der Pneumonie beim Menschen und fordern jährlich mehrere Millionen Opfer weltweit. Weiterhin können Koinfektionen mit Influenza A Viren die Erkrankung verschlimmern. Die Epithelzellen des humanen Respirationstraktes bilden die erste Verteidigungsbarriere gegen die Infektion. Es sind jedoch viele Aspekte der Interaktion zwischen Epithelzellen und S. pneumoniae noch nicht umfassend geklärt. Um diese Interaktion detailliert zu analysieren, wurde ein Expressionsprofil aus mRNAs, Proteinen und miRNAs von infizierten Bronchialepithelzellen erstellt. Zusätzlich wurde ein Koinfektionsmodell in humanem ex vivo Lungengewebe zu Vergleichszwecken untersucht. Signalweg‐Analysen der infizierten Epithelzellen ergaben eine verstärkte Regulation des Zellzyklus zum späten Zeitpunkt der Infektion (16 h). Eine Vernetzung der Daten mit dem miRNA‐Profil offenbarte wenige, bereits bekannte Verknüpfungen. Dennoch konnten mit Hilfe der miRNA‐Untersuchungen behandlungsabhängige Expressionsmuster detektierten werden, welche S. pneumoniae‐spezifische miRNAs, wie die induzierte miRNA‐3135b, aufzeigten. Bei dieser hypothetischen miRNA könnte es sich tatsächlich um ein t‐RNA‐deriviertes Fragment (tRF) handeln. Eine Überexpression der miRNA‐3135b resultierte in einer signifikanten Reduktion der Pneumokokken‐Last, was auf einen Abwehrmechanismus der Epithelzellen hindeutet. Zudem zeigte die RNA‐Sequenzierung nach miRNA‐3135b‐Überexpression verschiedene putative Ziel‐mRNAs, deren Funktionen bisher nur eingeschränkt bekannt sind. Des Weiteren weisen funktionelle Analysen der mRNAs und Proteine auf eine Regulation des Nicotinamidmetabolismus hin. Die in den Epithelzellen durchgeführte Depletion von NAMPT, dem Schlüsselenzym dieses Stoffwechselweges, führte zu einer verminderten Replikation von S. pneumoniae. Weiterhin bewirkte die Zugabe von Nicotinamid‐Mononukleotid (NMN) eine gesteigerte Replikationsrate der Bakterien. Dies deutet auf NMN als wichtige Nährstoffquelle von Pneumokokken hin. Die Daten dieser Arbeit erweitern die Kenntnisse zur Interaktion von humanen Epithelzellen und Pneumokokken und könnten zur Identifizierung alternativer und neuer Therapiestrategien genutzt werden

Globale Expressionsprofile Pneumokokken-infizierter Bronchialepithelzellen - Einfluss der miRNA-3135b und des Nicotinamidstoffwechselweges auf die bakterielle Replikation

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), auch als Pneumococcus bezeichnet, ist ein grampositives Bakterium, welches gewöhnlich als Kommensale asymptomatisch den humanen Nasopharynx besiedelt, jedoch auch schwere Erkrankungen bis hin zur Sepsis oder Meningitis auslösen kann. Pneumokokken sind Hauptverursacher der Pneumonie beim Menschen und fordern jährlich mehrere Millionen Opfer weltweit. Weiterhin können Koinfektionen mit Influenza A Viren die Erkrankung verschlimmern. Die Epithelzellen des humanen Respirationstraktes bilden die erste Verteidigungsbarriere gegen die Infektion. Es sind jedoch viele Aspekte der Interaktion zwischen Epithelzellen und S. pneumoniae noch nicht umfassend geklärt. Um diese Interaktion detailliert zu analysieren, wurde ein Expressionsprofil aus mRNAs, Proteinen und miRNAs von infizierten Bronchialepithelzellen erstellt. Zusätzlich wurde ein Koinfektionsmodell in humanem ex vivo Lungengewebe zu Vergleichszwecken untersucht. Signalweg‐Analysen der infizierten Epithelzellen ergaben eine verstärkte Regulation des Zellzyklus zum späten Zeitpunkt der Infektion (16 h). Eine Vernetzung der Daten mit dem miRNA‐Profil offenbarte wenige, bereits bekannte Verknüpfungen. Dennoch konnten mit Hilfe der miRNA‐Untersuchungen behandlungsabhängige Expressionsmuster detektierten werden, welche S. pneumoniae‐spezifische miRNAs, wie die induzierte miRNA‐3135b, aufzeigten. Bei dieser hypothetischen miRNA könnte es sich tatsächlich um ein t‐RNA‐deriviertes Fragment (tRF) handeln. Eine Überexpression der miRNA‐3135b resultierte in einer signifikanten Reduktion der Pneumokokken‐Last, was auf einen Abwehrmechanismus der Epithelzellen hindeutet. Zudem zeigte die RNA‐Sequenzierung nach miRNA‐3135b‐Überexpression verschiedene putative Ziel‐mRNAs, deren Funktionen bisher nur eingeschränkt bekannt sind. Des Weiteren weisen funktionelle Analysen der mRNAs und Proteine auf eine Regulation des Nicotinamidmetabolismus hin. Die in den Epithelzellen durchgeführte Depletion von NAMPT, dem Schlüsselenzym dieses Stoffwechselweges, führte zu einer verminderten Replikation von S. pneumoniae. Weiterhin bewirkte die Zugabe von Nicotinamid‐Mononukleotid (NMN) eine gesteigerte Replikationsrate der Bakterien. Dies deutet auf NMN als wichtige Nährstoffquelle von Pneumokokken hin. Die Daten dieser Arbeit erweitern die Kenntnisse zur Interaktion von humanen Epithelzellen und Pneumokokken und könnten zur Identifizierung alternativer und neuer Therapiestrategien genutzt werden

Streptococcus pneumoniae disrupts the structure of the golgi apparatus and subsequent epithelial cytokine response in an H2O2-dependent manner

Abstract Background Lung infections caused by Streptococcus pneumonia are a global leading cause of death. The reactive oxygen species H2O2 is one of the virulence factors of Streptococcus pneumoniae. The Golgi apparatus is essential for the inflammatory response of a eukaryotic cell. Golgi fragmentation was previously shown to be induced by bacterial pathogens and in response to H2O2 treatment. This led us to investigate whether the Golgi apparatus is actively involved and targeted in host–pathogen interactions during pneumococcal infections. Methods Following in vitro infection of BEAS-2B bronchial epithelial cells with Streptococcus pneumoniae for 16 h, the structure of the Golgi apparatus was assessed by fluorescence staining of the Golgi-associated protein, Golgin-97. To investigate the effect of H2O2 production on Golgi structure, BEAS-2B cells were treated with H2O2 or the H2O2 degrading enzyme Catalase, prior to Golgi staining. Artificial disruption of the Golgi apparatus was induced by treatment of cells with the GBF1 inhibitor, Golgicide A. A proinflammatory cellular response was induced by treatment of cells with the bacterial cell wall component and TLR4 ligand lipoteichoic acid. Results In vitro infection of bronchial epithelial cells with wild type Streptococcus pneumoniae led to a disruption of normal Golgi structure. Golgi fragmentation was not observed after deletion of the pneumococcal H2O2-producing gene, spxB, or neutralization of H2O2 by catalase treatment, but could be induced by H2O2 treatment. Streptococcus pneumoniae infection significantly reduced host cell protein glycosylation and artificial disruption of Golgi structure significantly reduced bacterial adherence, but increased bacterial counts in the supernatant. To understand if this effect depended on cell-contact or soluble factors, pneumococci were treated with cell-supernatant of cells treated with Golgicide A and/or lipoteichoic acid. This approach revealed that lipoteichoic acid conditioned medium inhibits bacterial replication in presence of host cells. In contrast, artificial Golgi fragmentation by Golgicide A treatment prior to lipoteichoic acid treatment rescued bacterial replication. This effect was associated with an increase of IL-6 and IL-8 in the supernatant of lipoteichoic acid treated cells. The increased cytokine release was abolished if cells were treated with Golgicide A prior to lipoteichoic acid treatment. Conclusion Streptococcus pneumoniae disrupts the Golgi apparatus in an H2O2-dependent manner, thereby inhibiting paracrine anti-infective mechanisms. Video Abstrac

NAD+ metabolism is a key modulator of bacterial respiratory epithelial infections

Lower respiratory tract infections caused by Streptococcus pneumoniae (Spn) are a leading cause of death globally. Here we investigate the bronchial epithelial cellular response to Spn infection on a transcriptomic, proteomic and metabolic level. We found the NAD salvage pathway to be dysregulated upon infection in a cell line model, primary human lung tissue and in vivo in rodents, leading to a reduced production of NAD . Knockdown of NAD salvage enzymes (NAMPT, NMNAT1) increased bacterial replication. NAD treatment of Spn inhibited its growth while growth of other respiratory pathogens improved. Boosting NAD production increased NAD levels in immortalized and primary cells and decreased bacterial replication upon infection. NAD treatment of Spn dysregulated the bacterial metabolism and reduced intrabacterial ATP. Enhancing the bacterial ATP metabolism abolished the antibacterial effect of NAD . Thus, we identified the NAD salvage pathway as an antibacterial pathway in Spn infections, predicting an antibacterial mechanism of NAD